Ardından İstanbul Bilgi Üniversitesi İletişim Fakültesi Radyo Televizyon ve Sinema Bölümü'nde asistanlık yaptı.
Oyunculuğa adım attığı yıllarda Uğur Yücel ile çalışarak kariyerine hızlı bir başlangıç yapan Defne Kayalar, 2003 yılında "Alacakaranlık" dizisi ve 2004 yılında "Yazı Tura" filmi ile dikkatleri üzerine çekti.